1、血清
A、DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物構(gòu)成時(shí)不能含血清，由于血清會(huì)影響復(fù)合物的構(gòu)成。
B、一般細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)能夠耐受幾個(gè)小時(shí)沒(méi)問(wèn)題，轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液能夠含血清也能夠不加，但血清一度曾被以為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中參加血清需求對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。
C、關(guān)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，能夠運(yùn)用養(yǎng)分豐厚的無(wú)血清培養(yǎng)基，或許在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中運(yùn)用血清。對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議運(yùn)用轉(zhuǎn)染試劑。有條件的話，能夠用無(wú)血清培養(yǎng)基代替PBS洗細(xì)胞兩遍，注意洗的時(shí)分要輕，靠邊際緩緩參加液體，然后不要吹吸細(xì)胞，而是滾動(dòng)培養(yǎng)板讓液體滾動(dòng)在細(xì)胞表面。假如洗的太厲害，細(xì)胞又損失一部分，加了脂質(zhì)體后，細(xì)胞受影響就更大了，死亡細(xì)胞會(huì)增多。
2、抗生素(PS)
抗生素，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般關(guān)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素能夠進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能運(yùn)用抗生素，甚至在預(yù)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要防止運(yùn)用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不用潤(rùn)洗細(xì)胞。關(guān)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中運(yùn)用青霉素和鏈霉素，ICIN選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外，為了保證無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康成長(zhǎng)，運(yùn)用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。
3、細(xì)胞狀況
這點(diǎn)非常重要，不要急于求成，必定要讓細(xì)胞處于jia的成長(zhǎng)狀況再做。有文獻(xiàn)說(shuō)傳代不要超越17代。細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時(shí)細(xì)胞狀況hao，不要用傳了許多代的細(xì)胞去做，細(xì)胞的形態(tài)都會(huì)發(fā)生改變。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包含了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在試驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控改變等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的改變。假如隨時(shí)刻發(fā)現(xiàn)這種改變，消融一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。
4、細(xì)胞鋪板密度
用于轉(zhuǎn)染的jia細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或使用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有毒害效果，細(xì)胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)滿或處于靜止期。由于轉(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感，所以在不同試驗(yàn)間堅(jiān)持一個(gè)根本的傳代步驟很重要。
5.啟動(dòng)子的選擇
取得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中能夠取得高表達(dá)活性。同其他啟動(dòng)子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒)相比，在BHK-21中其活性高。這三種病毒啟動(dòng)子在T細(xì)胞來(lái)歷的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。
6、DNA量
高質(zhì)量的DNA關(guān)于進(jìn)行的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒必定純度好、濃度高、無(wú)內(nèi)毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。產(chǎn)物表達(dá)，48小時(shí)mRNA表達(dá)gao；72h蛋白表達(dá)gao。
在線咨詢